Почему вестерн-блот используется для подтверждения elisa? + Пример

Ответ:

Обычно это тест на специфичность антитела.

Объяснение:

В ELISA очень трудно определить, связывается ли ваше антитело с вашим интересующим белком, совершенно другим белком или рядом белков.

Вестерн-блот будет использоваться для проверки специфичности антитела (следует помнить, что вестерн-блот может не обнаруживать все перекрестные реакции с неправильными белками).

В Вестерн-блоттинге вы можете видеть размер белка, с которым связывается антитело (вы не можете это сделать в ELISA). Поэтому, например, если ваше антитело должно связываться с белком 56 кДа, и вы видите полосу в ~ 56 кДа на блоте, тогда вы можете быть достаточно уверены, что антитело связывается с нужным белком.

Если, с другой стороны, вы увидели полосу в 32 кДа, вы могли бы заключить, что антитело связывается с неправильным белком. Аналогичным образом, если бы на Вестерн-блоттинге обнаружилось много полос, то это указывало бы (в отсутствие деградации белка), что антитело связывалось с рядом различных белков.

В примере полосы 32 кДа, появляющейся на геле, а также множества полос, можно предположить, что антитело не обладает специфичностью для ELISA и что любые результаты, наблюдаемые в ELISA, могут не быть специфичными для белка, представляющего интерес.

Если бы я проходил такой тест, я мог бы включить некий «мешающий» реагент для тестирования антител. Например, если я поднял свое антитело к пептиду, я могу включить пептид в раствор первичного антитела, чтобы проверить правильность связывания. То есть, в присутствии пептида я не должен видеть никакой полосы или никакого результата от ELISA, поскольку мое первичное антитело не сможет связываться из-за присутствия избытка пептида.