В чем может быть проблема, если группы не появляются в Western Blot?

Ответ:

Много…

Объяснение:

Есть много причин, по которым полосы могут не появляться на вестерн-блоте. Работали ли комбинации образцов и антител в прошлом?

Ниже приведены лишь некоторые из тех, о которых я могу подумать в данный момент и которые могут привести к тому, что группы не будут появляться:

1. Переносил ли белок из геля? Попробуйте окрасить мембрану чем-то вроде понсо S или амидо-черного, чтобы увидеть, присутствуют ли полосы. Иногда вы можете увидеть белковые полосы на мембране, смачивая ее и удерживая под углом к свету.

2. Работает ли первичное антитело? Это сложно проверить, и единственный способ, которым вы можете это сделать, - включить положительный контроль, если вы знаете, что у вас есть интересующий белок. Если у вас есть какой-то белок, представляющий интерес, вы можете попробовать нанести его на мембрану для вестерн-блоттинга (т.е. вы не запускаете гель) и посмотреть, получите ли вы результат, если обработаете мембрану, как если бы она была вестерн-блоттингом.

3. Вторичное антитело распознает первичное антитело? Опять же, сложный для тестирования. Единственный тест, который вы можете сделать, это выборочный тест, упомянутый выше в 2.

4. Работает ли "система обнаружения"? В зависимости от метода обнаружения, который вы используете, вы можете попробовать добавить некоторое количество вторичного антитела, чтобы увидеть, работает ли раствор для обнаружения, а также запускающий агент / фермент на вторичном антителе. То есть, вы можете вызвать реакцию только с вторичным антителом?

Наконец, это может быть так же просто, как одно из решений, использованных при зондировании участка, которое составлено неправильно. Например, если концентрация соли в буфере неверна, это может привести к высвобождению антител из блоттинга. То же самое произошло бы, если бы pH буферов был неправильным.

«Самая странная» причина для неработающего вестерн-блоттинга, который я лично испытал, была в том, что мы сменили поставщика сухого молока, который мы использовали для блокировки мембраны. Порошок от нового поставщика содержал фосфотирозинфосфатазу, которая удаляла все фосфатные группы, которые мы пытались обнаружить с помощью нашего антифосфотирозинового антитела.